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华东师范大学用CRISPR编辑啮齿动物单细胞胚胎

发布时间:2015-12-03 11:24 |  点击次数:

 

来自华东师范大学的研究人员报告称,他们采用Cas9蛋白来删除基因组大片段及敲入功能性基因盒(gene cassette),完成了对啮齿动物单细胞胚胎的基因组编辑。这一成果发布在12月1日的《Scientific Reports》杂志上。
 
华东师范大学生科院生命医学研究所刘明耀(Mingyao Liu)教授和李大力(Dali Li)副教授是这篇论文的共同通讯作者。前者主要从事G蛋白偶联受体(GPCR)在个体发育和重大疾病发生发展过程中的功能及信号转导机理研究,从而进行靶向新药研发。后者主要研究领域是结合分子生物学手段及转基因、小鼠基因敲除技术研究GPCR和组蛋白修饰酶的生物学功能。
 
基因工程动物,尤其是小鼠和大鼠不仅在基础研究中具有极大的价值,更重要的是可用于建立疾病模型和开发治疗策略。能够通过自主同源重组实现对小鼠胚胎干细胞的位点特异性基因工程操作代表了一个重大的科技突破。但传统的基因打靶耗费人力、财力和时间且低效,一直被用来改造基因组DNA大片段。通过生成位点特异性DNA双链断裂(DSBs),可编程核酸酶如锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)和CRISPR- Cas9系统现已被广泛用于完成精确基因组编辑,在细胞和动物体内实现基因敲除、敲入及染色体重排。
 
不同于ZFNs和TALENs是通过一对串联重复序列来识别基因组靶位点,改进的CRISPR/Cas系统是通过核酸内切酶Cas9和一条合成的单导向RNA(sgRNA)来识别靶位点,sgRNA通过Watson-Crick碱基配对原则将Cas9引导至靶DNA处。由于它的灵活性、简便性及高效性,研究人员一直在深入探索CRISPR/Cas的许多潜在应用。尽管一系列的研究证实通过双切口或缩短sgRNA长度等方法可以提高特异性,Cas9介导基因打靶时存在的脱靶位点仍然让研究人员感到极为担心。
 
在稳定细胞系中长时间发挥核酸酶活性,被认为是导致CRISPR/Cas系统在细胞内造成高频脱靶效应的部分原因。近期,有两个研究小组报告称通过将重组Cas9蛋白和sgRNAs导入到细胞中,可提高CRISPR/Cas系统的活性和精度。尽管初期研究证实通过直接注射Cas9 蛋白/sgRNA,可高效生成基因敲除斑马鱼和小鼠,但少有研究报道利用这种方法成功敲除了DNA大片段或是敲入了功能性基因盒。
 
在这篇文章中研究人员将Cas9蛋白(而非mRNA)注入到了胚胎中,证实这种方法可以减少Cas9的脱靶效应,提高点突变敲入效率。他们构建出了删除基因组DNA大片段(达95 kb)的小鼠,用于体内研究lncRNAs和基因簇。并将2.7 kb CreERT2基因盒位点特异性地插入到了小鼠Nfatc1位点,使得能够标记和追踪毛囊干细胞。此外,研究人员结合Cre-Loxp系统与基因诱捕技术将GFP报告基因反向插入到了大鼠Lgr5位点,通过Cre介导的重组使之反向,生成了一种条件性基因敲除/报告基因策略用于分析嵌合突变。
 
新研究证实了,重组Cas9蛋白是一种极好的替代选择,用于构建各种遗传工程动物模型。

信息来源:生物通